Ik woonde een lezing bij van Josh Quick op PoreCampAU 2017, waarin hij enkele veelvoorkomende belemmeringen besprak om zowel een goede sequentieopbrengst als een lange leesduur te krijgen. Het komt vooral neer op voorzichtiger zijn met de monstervoorbereiding. Houd er rekening mee dat de MinION nog steeds een vies monster zal sequencen, het zal alleen een lagere opbrengst hebben. Hier zijn mijn aantekeningen van die lezing:

• Het moeilijkste aan MinION-sequencing is om de sample in de eerste plaats te krijgen
• Er zijn veel verschillende soorten samples en extractiemethoden
• U kunt niet langer worden gelezen dan wat u erin stopt; shit in leidt tot shit out
• DNA is erg stabiel als het niet beweegt, maar erg gevoelig voor laterale schade
• De fenolchloroformmethode voor DNA-extractie is erg goed en kan worden gebruikt met een fasevergrendelde gel om extractie gemakkelijker te maken
• Een eenvoudige extractie van zout en alcohol is misschien wel de beste methode voor extractie (omdat het de minste hoeveelheid werk aan het DNA met zich meebrengt)
• EDTA (bijv. zoals aangetroffen in TE-buffer, en veel extractiekits) is niet compatibel met de snelle kit
• De meest consistent goede Nanopore-runs geproduceerd door Josh's laboratorium waren 1D-ligatie-runs op R9.4; de beste overall run was een fenol-chloroform extractie + snelle kit
• John Tyson kan zichzelf afstemmen op een gat met een lage opbrengst (via software)
• Kleine aantallen korte reads krijgen is zeer belangrijk
• Voorgestelde (en meestal niet-geteste) zuiveringstechnieken: spinkolom (60-100kb); ethanolextractie (100-150 kb), dialyse (150-250 kb); agarose-plug met laag smeltpunt (~ 1Mb, DNA-extractie in situ)
• De invoer van het nanoporie-protocol is in nanogrammen, maar zou eigenlijk als molariteit moeten worden vermeld; de kit verwacht een input van ongeveer 0,2 pmol.
• Beeldmoleculen die aan het oppervlak van het membraan zijn vastgemaakt. U kunt dan zien dat de stroomceldichtheid onafhankelijk is van de sequentielengte
• Tapestation, Qubit en Nanodrop zijn allemaal een goed idee; een DNA-monster dat alle drie de tests kan doorstaan, zal goed werken: geen korte schouders door Tapestation, voldoende DNA door Qubit, hoge zuiverheid door Nanodrop
• RNA kan de sequentiebepaling verstoren; RNA verteren wordt aanbevolen.
• DNA invriezen is een heel slecht idee. De ijskristallen zijn erg goed in het versnipperen van DNA in kleine stukjes
• DNA dat in de koelkast wordt bewaard, is opmerkelijk stabiel; kan meer dan twee jaar (en waarschijnlijk voor onbepaalde tijd) worden bewaard.

Update over opbrengst:

We hadden een run in juni 2018 die ongeveer 3 miljoen reads van PCR- geamplificeerd muis-cDNA (lees N50 van ~ 1kb), en dat was in een situatie waarin het het eerste monster was dat door iemand was bereid, de hoeveelheid ingevoerde DNA waarschijnlijk ongeveer 20% was van wat het had moeten zijn, en we hadden een datalossincident . Als dat is gebeurd met een slechte run, heb ik hoge verwachtingen van onze runs in de toekomst.

Onze volgende cDNA-run in augustus 2018 produceerde ongeveer 7 miljoen reads en een vergelijkbare read N50 (dwz totale opbrengst van ongeveer 7 GB). De run werd de eerste nacht onderbroken door een Windows-update (ik had eerder automatische updates uitgeschakeld, maar ze waren opnieuw ingeschakeld) en sindsdien zijn er aanvullende software- en hardware-updates geweest om de opbrengst van sequencing te verbeteren. Als we een goede doorstroomcel hebben en een vergelijkbare sample-voorbereiding, verwacht ik dat de volgende cDNA-run die we zullen doen meer dan 8 miljoen reads zal opleveren, en mogelijk meer dan 10 miljoen.

Ik durf te wedden dat de nanopore-mensen (natuurlijk!) een hoop optimalisatie hebben gedaan op twee belangrijke dingen:

1. De DNA-opruiming
2. De bibliotheek bereidt zich voor

Ik denk dat opruimingen voor de meeste DNA-extracties erg kunnen variëren, maar zoiets als een Blue Pippin zal uitzonderlijk werk doen als je er toegang toe hebt en het kunt gebruiken (ze werken niet voor SUPER lange DNA-fragmenten die natuurlijk niet door een gel kunnen bewegen). De Blue Pippin doet ook je maatselectie, zodat je de poriën niet verbrandt door veel kleine dingen te sequencen. Dit zou ook moeten helpen opleveren.

Dan komt het allemaal neer op de voorbereiding van de bibliotheek, en @ gringer's antwoord heeft daar een aantal goede tips over.

Ik werk met een schimmel en gebruik de CTAB-methode voor DNA-extractie en ik heb de Rapid Kit gebruikt voor mijn eerste bibliotheekvoorbereiding, maar het werkte niet en sindsdien gebruik ik een ligatiekit en het heeft me zeer goede resultaten opgeleverd . Het lukte me om gegevens van 4 GB tot 13 GB te krijgen.